SALVARCI LA PELLE CON LE BIOTECNOLOGIE

DIAGNOSTICARE, PREVENIRE E CURARE!

L'applicazione in campo biomedico di molti processi biotecnologici, che hanno portato alla nascita delle biotecnologie per la diagnostica, la prevenzione e la terapia, è da attribuire alla scoperta e allo studio degli enzimi di restrizione, allo sviluppo e all'automazione dei metodi per analizzare le sequenze del DNA, allo sviluppo della bioinformatica, alla scoperta della reazione di polimerizzazione a catena, meglio nota come PCR, alla produzione di anticorpi monoclonali, cioè cellule che producono sempre lo stesso anticorpo, e alle conoscenze relative alla trasmissione dell'informazione genetica, alla replicazione, alla trascrizione (sintesi dell'RNA dal DNA) e alla traduzione (biosintesi delle proteine). Le biotecnologie per la diagnosi, la prevenzione e la terapia comprendono tutte le tecniche volte a consentire lo sviluppo di misure diagnostiche e preventive, come ad esempio la sintesi di vaccini, al fine di intervenire tempestivamente nel trattamento di patologie, e la produzione di farmaci e antibiotici per il trattamento terapeutico. Passiamo ora ad analizzare quali sono le applicazioni di maggiore interesse in tale settore. 

PRODUZIONE DI FARMACI DI NATURA PROTEICA, ANTIBIOTICI E "VACCINI RICOMBINANTI"

Tecnica illustrativa della sintesi di vaccini ricombinanti

Tra le varie applicazioni delle biotecnologie per la diagnostica, la prevenzione e la terapia ricordiamo la produzione di farmaci di natura proteica, fino a poco tempo fa disponibili in quantità ridotte, attraverso l'utilizzo della tecnologia del DNA ricombinante  che consente la manipolazione del genoma. Praticamente, si procede con l'isolamento del cDNA del gene che contiene l'informazione per la sintesi della proteina di interesse e si inserisce in un plasmide che funziona da vettore in grado di veicolare il DNA estraneo nella cellula batterica in cui sarà data espressione al gene. Tra le prime proteine prodotte per via ricombinante è da ricordare l'insulina, un ormone pancreatico che stimola il catabolismo del glucosio e blocca la glicogenolisi, la cui carenza determina il diabete mellito. Tale meccanismo è lo stesso utilizzato per la sintesi di antibiotici e i "vaccini ricombinanti" che, a differenza dei vaccini tradizionali, costituiti da antigeni attenuati o uccisi, sono costituiti dagli antigeni meno pericolosi dei microrganismi che determinano la risposta anticorpale.

TERAPIA GENICA 

Un'altra applicazione di rilevante interesse è la terapia genica finalizzata alla correzione di un difetto che provoca determinate anomalie somatiche, per somministrazione del gene normale. L'approccio tipico, che prevede l'utilizzo di un retrovirus come vettore per sostituire il gene mutato con una copia funzionale, ha dato risultati parzialmente positivi nel trattamento di alcune forme di immunodeficienza grave, accompagnati però da gravi effetti collaterali. Negli ultimi due anni è stata però proposta una strategia differente che prevede la “riparazione” del gene difettoso, grazie a una tecnica denominata editing del genoma, introdotta per la prima volta dal premio Nobel Mauro Capecchi. Il meccanismo sfrutta le proprietà di una nucleasi artificiale, cioè di un enzima, prodotto in laboratorio, in grado di rompere la catena del DNA prima e dopo la sequenza nucleotidica mutata, isolandola, permettendo così la sostituzione con una copia funzionale del gene, che viene trasportata in situ da un vettore virale. Lo scambio tra la sequenza mutata e quella funzionale avviene grazie a un processo denominato ricombinazione omologa. Quest'ultima è un meccanismo fisiologico che consente alla cellula di riparare rotture incidentali nella sequenza genica, non ci sono effetti negativi su altre regioni genomiche, come per esempio sulle sequenze che controllano i fattori di regolazione del DNA. 

PREVENZIONE DELLE MALATTIE EREDITARIE E GENETICHE

Sequenziamento del DNA

Un'importante applicazione delle biotecnologie per la diagnostica e la prevenzione di malattie ereditarie e genetiche è l'analisi dettagliata della sequenza di basi del gene normale che codifica per la proteina di interesse. In generale, il metodo prevede l'amplificazione con la tecnica della PCR, del segmento di DNA di interesse, del quale si dispone di solito in quantità molto piccola, e il confronto tra i frammenti che si ottengono con opportuni enzimi di restrizione e quelli ricavati dal gene normale. Il confronto si fa valutando direttamente le dimensioni dei diversi frammenti con metodiche elettroforetiche, oppure attraverso il trasferimento su nitrocellulosa (Southern blotting). Quest'ultimo metodo consente la successiva 'ibridazione' con un DNA a sequenza nota (sonda) radioattivo o fluorescente, in grado di evidenziare, per formazione di strutture complementari, sequenze specifiche del gene normale o del gene mutato. Queste tecniche vengono usate anche nella diagnostica dei tumori, ricercando l'eventuale presenza di particolari geni, chiamati oncogèni perché nei tessuti tumorali subiscono mutazioni responsabili della trasformazione neoplastica. Allo stesso modo vengono oggi diagnosticate malattie da microrganismi o da virus (epatiti, infezione da HIV, il virus che provoca l'AIDS ecc.). 

  PREVENZIONE DELLA MALARIA!

Zanzara Anopheles

La malaria è una malattia determinata dalla puntura della zanzara Anopheles femmina attraverso la quale viene trasmesso l'agente eziologico: il plasmodio della malaria. Per ridurre l'incidenza della malattia si è cercato di intervenire con l'eliminazione del vettore di infezione attraverso l'uso di insetticidi. Il fallimento di tale progetto ha spinto gli scienziati a tentare di diminuire la popolazione di insetti mediante l’inserimento nella popolazione di numerosi individui sterili, ottenuti mediante irradiazione con i raggi X. In questo modo viene drasticamente diminuita la popolazione, rendendo inefficaci e privi di prole tutti gli accoppiamenti con individui sterili. L'aspetto negativo dell'uso dei raggi X è che essi colpiscono e distruggono a caso, non limitandosi ai geni importanti solo per la fecondità della zanzara, ma colpendo i geni necessari per il corteggiamento nel maschio della zanzara. Tutti i ditteri (l’Anopheles è un dittero) svolgono un sofisticato e complesso corteggiamento assolutamente necessario in tutte le sue fasi per raggiungere i favori dell’Anopheles femmina. Per diminuire il numero delle zanzare portatrici del Plasmodio è necessario, dunque, distruggere i geni non a caso, ma solo quelli che presiedono alla fertilità. L'ISS è riuscito a selezionare uno di questi geni.  L’uovo della zanzara è chiuso in una camera ovarica costituita dall’uovo che non ha biosintesi e da numerose cellule nutrici, che trasferiscono all’uovo proteine, acidi nucleici, lipidi che vanno a far ingrandire l’uovo finché raggiunge la maturità. Le sostanze sintetizzate dalle cellule nutrici per raggiungere l’uovo passano attraverso canali chiamati "ring canals", che quando la zanzara è ridotta alla fame si chiudono. Quando la femmina trova il pasto di sangue e se ne ciba i rings canals si riaprono e l’uovo può crescere per arrivare alla maturazione. L’abbondante pasto di sangue ricco in proteine fa produrre alla zanzara l’ecdisone che è un ormone che induce la riapertura dei rings. L’ecdisone agisce su un gene kelch, che è responsabile di tenere aperti i ring canals. Se questo solo gene è mutato i rings rimarranno chiusi e l’uovo degenererà rendendo sterile la zanzara. Zanzare sterili ma perfettamente in grado di accoppiarsi possono essere prodotte per mutazione di questo solo gene: il gene kelch.

Fonti: http://www.treccani.it/enciclopedia/biotecnologie_%28Universo_del_Corpo%29/

http://www.lescienze.it/news/2014/05/28/news/un_passo_avanti_per_la_terapia_genica-2161220/
http://www.iss.it/binary/publ/cont/28.1231840836.pdf

CURARSI CON LE CELLULE STAMINALI

COSA SONO LE CELLULE STAMINALI? (LINK)

Le cellule staminali sono cellule il cui destino non è ancora "deciso". Possono originare vari tipi di cellule diverse, attraverso un processo denominato "differenziamento".

Nelle fasi iniziali dello sviluppo umano sono situate nell'embrione e sono diverse da tutti i tipi di cellule esistenti nell'organismo. La possibilità di controllare lo spettacolare potere di queste cellule staminali embrionali, allo scopo di curare vari tipi di malattie, entusiasma gli studiosi. Per esempio, si spera che in un futuro prossimo, la ricerca potrà rivoluzionare il modo di curare tante malattie come l'ictus, il diabete, le malattie cardiache le paralisi, il morbo di Parkinson e l'Alzheimer. 

Gli atteggiamenti verso l'uso di cellule staminali a fini di ricerca o di cure mediche variano da un paese all'altro. In Germania, per esempio, l'estrazione di cellule staminali da un embrione umano è considerata illegale, in Gran Bretagna è legale, ma le leggi in materia sono rigorose: gli scienziati britannici possono utilizzare embrioni umani a fini di ricerca fino a quattordici giorni dopo la fecondazione dell'ovulo. In questo momento, l'embrione è un insieme di cellule, grande più o meno come un quarto della testa di uno spillo (0,2 mm). In molti paesi non esistono invece ancora leggi esplicite atte a disciplinare la ricerca sulle cellule staminali umane.

Essendo l'utilizzo di embrioni una questione di grande controversia in termini etici, gli scienziati di tutto il mondo cercano altre fonti di cellule staminali. Il tipo di cellule staminali che si trova nel midollo osseo degli adulti sembra essere una possibilità. Queste cellule staminali sono potenzialmente già capaci di differenziarsi in una gran varietà di globuli rossi nell'arco del ciclo vitale. In futuro, gli scienziati sperano di manipolare queste cellule staminali adulte affinché, invece di produrre soltanto globuli rossi, possano dare origine a cellule cerebrali, epatiche, cardiache e nervose.

Le cellule staminali embrionali possono aiutare a recuperare la vista? (LINK)

Nel caso delle malattie dell’occhio si è andati forse oltre le aspettative.

La degenerazione della macula è una delle cause principali della perdita della vista per persone sopra i 65 anni. Una piccola azienda di biotecnologie con sede a Marlborough,ha trapiantato cellule cresciute in laboratorio negli occhi di nove pazienti affetti da degenerazione maculare e nove affetti da distrofia maculare di Stargardt. L'idea alla base della cura della Advanced Cell è quella di sostituire con cellule cresciute in laboratorio le cellule dell'epitelio retinico pigmentato, conosciute come cellule RPE, un tipo di tessuto di supporto, senza il quale i fotorecettori di una persona muoiono.

L'obiettivo principale della ricerca è stato dimostrare la sicurezza delle cellule. I ricercatori non hanno riscontrato effetti collaterali e hanno sostenuto di aver osservato alcuni miglioramenti nei pazienti: per la metà di loro la vista è migliorata. Molti specialisti in oculistica sostengono però che è troppo presto per dire se l'aumento della vista sia reale. I pazienti non sono stati esaminati da specialisti "indipendenti", spiegano, e il grado di visione in pazienti con problemi di vista è notoriamente difficile da valutare. Questo lascia ampio spazio all'effetto placebo o all'inconscia parzialità di alcuni medici. Stephen Tsang, un medico della Columbia University, contesta alcune delle prove fotografiche della Advanced Cell, che mostrano la sopravvivenza delle cellule trapiantate. 

Un altro interessante impiego delle staminali?

Riparazione del tessuto bronchiale con cellule staminali mesenchimali (LINK)

Il New England Journal of Medicine, ha pubblicato i risultati del primo caso mai realizzato di riparazione del tessuto bronchiale con cellule staminali, che decreta in modo definitivo il passaggio dal laboratorio alla clinica di queste cellule, studiate ovunque nel mondo per il loro potere di rigenerarsi nei tessuti in cui sono trasferite. La tecnica è stata sviluppata dal dott. Francesco Petrella.

"Abbiamo prelevato le cellule staminali (cellule staminali adulte mesenchimali) dal midollo osseo del paziente, un giovane di 42 anni sottoposto all'asportazione del polmone destro per mesotelioma pleurico - spiega Petrella – Le abbiamo espanse e poi inoculate tramite una metodica mininvasiva, la broncoscopia flessibile, nell'area del bronco dove si era creata una fistola post-chirurgica, una sorta di "ferita aperta" tra il bronco e il cavo pleurico, dovuta alla mancata cicatrizzazione fisiologica che normalmente avviene dopo la chirurgia.

La metodica si è rivelata efficace nello stimolare la cicatrizzazione del bronco, evitando così altri interventi invalidanti. Oggi, a otto mesi dal trapianto di staminali, il paziente sta bene e non ha avuto recidive."

"Per quanto ad oggi conosciamo sulle cellule staminali mesenchimali - continua Petrella - sappiamo che sono in grado di migrare ed attecchire nelle aree di infiammazione e di danno ai tessuti. Una volta impiantate nel sito bersaglio da curare, nel nostro caso la fistola bronchiale, le cellule staminali mesenchimali hanno la capacità di instaurare un contatto con il microambiente cellulare circostante, fenomeno definito in termini tecnici "cross-talk", che consente un processo di riparazione e/o rigenerazione, con graduale ripristino delle funzioni danneggiate." Il professore si dichiara entusiasta di aver dimostrato clinicamente che le staminali adulte possono indurre una riparazione "naturale", contribuendo allo sviluppo delle tecniche del trapianto del bronco e anche della trachea. Il trapianto con staminali infatti non crea rigetto."

Le staminali segnano anche un importante passo verso la guarigione della sclerosi multipla: Sclerosi multipla: trattamento con cellule staminali del sangue (LINK)

Secondo uno studio multicentrico  internazionale, nel trattamento dei casi gravi di sclerosi multipla (SM) l’intensa immunosoppressione seguita da trapianto autologo di cellule staminali ematopoietiche è più efficace rispetto alla terapia farmacologica standard a base di mitoxantrone.

Lo studio di fase II, durato oltre 15 anni, ha coinvolto 21 persone affette da SM secondaria progressiva o recidivante-remittente, la cui disabilità era peggiorata nel corso dell'anno precedente nonostante il trattamento con farmaci di prima linea. Tutti i partecipanti, di età media pari a 36 anni, avevano ricevuto in precedenza, senza risultato, terapie standard per contrastare l’attività di aggressione del sistema immunitario contro la guaina mielinica delle cellule nervose. Nel corso dello studio, 12 dei partecipanti hanno ricevuto il farmaco immunosoppressore mitoxantrone, mentre agli altri nove partecipanti è stata somministrata una potente terapia immunosoppressiva con successiva infusione di cellule staminali del sangue emopoietiche che erano state precedentemente raccolte dagli stessi pazienti. Questa procedura, comunemente denominata autotrapianto di midollo osseo, è utilizzata per il trattamento di grave malattie del sangue e, da alcuni anni, anche nel campo delle malattie autoimmuni. Nel corso del tempo, le cellule staminali migrate nel midollo osseo hanno prodotto nuove cellule immunitarie.

I partecipanti sono stati seguiti per i quattro anni successivi alla randomizzazione, durante i quali l’immunosoppressione intensa seguita dal trattamento con cellule staminali sembra aver ridotto l'attività della malattia in maniera molto più significativa di quanto non abbia fatto il trattamento con mitoxantrone. Coloro che hanno ricevuto il trapianto di cellule staminali hanno infatti presentato l'80% in meno di nuove lesioni cerebrali, chiamate lesioni T2, rispetto a quelli che hanno ricevuto mitoxantrone, con una media di 2,5 nuove lesioni T2 per coloro che sono stati trattati con le cellule staminali rispetto alle otto nuove lesioni T2 per i pazienti che hanno ricevuto il mitoxantrone.

“Il trapianto è stato globalmente ben tollerato, con effetti collaterali prevedibili e risolti senza alcuna conseguenza permanente” ha dichiarato il Dottor Riccardo Saccardi, che ha coordinato il versante ematologico dello studio. 

I pazienti trattati con cellule staminali, inoltre, hanno mostrato un altro beneficio: le lesioni captanti il gadolinio, un altro tipo di lesioni associate alla SM, non si sono più ripresentate, mentre il 56% dei pazienti trattati con mitoxantrone ha avuto almeno una nuova lesione.

Anticorpi monoclonali sfidano batteri resistenti a molti antibiotici

COSA SONO GLI ANTICORPI MONOCLONALI (LINK)?

Ogni specifico anticorpo, che riconosce uno specifico determinante antigenico (epitopo), è prodotto da uno specifico linfocita B. L'isolamento e la coltura in vitro di una cellula capace di produrre un singolo anticorpo rappresenta una fonte di anticorpi monoclonali (monospecifici). 

Tuttavia i linfociti B, quando sono coltivati in vitro, muoiono dopo brevissimo tempo, e quindi non possono essere una fonte per la produzione a lungo termine di anticorpi. La tecnologia dell'anticorpo monoclonale comprende l'isolamento di questi linfociti B, e la loro successiva fusione con cellule trasformate (cellule mielomatose), utili per le loro caratteristiche di maggior crescita e sopravvivenza. Molte delle risultanti cellule ibride (o ibridomi), che vengono coltivate in vitro, manterranno la capacità di vivere per un tempo più lungo, oltre a produrre grandi quantità dell'anticorpo monospecifico.

La fusione tra i linfociti B (provenienti dalla milza e dai linfonodi di un animale immunizzato) e il mieloma di topo (l'animale più usato), viene ottenuta per intervento di un promotore di fusione di membrana, come il polietilenglicole. Il terreno su cui sono allevati gli ibridi è di tipo selettivo e inibisce la crescita sia dei mielomi che delle cellule della milza non fuse, ma non dell’ibridoma che completa le due linee parentali.

Gli ibridomi vengono separati per tipologia in pozzetti di una piastra da microdosaggio e sono successivamente saggiati mediante Test ELISA non competitivo indiretto per individuare quelli che sintetizzano l'anticorpo desiderato. Gli ibridomi così selezionati possono essere propagati in vitro e/o conservati in azoto liquido per poi essere utilizzati in un secondo momento. 

Una nuova efficace arma contro i ceppi batterici resistenti a molti antibiotici, rimodellando gli anticorpi con gli strumenti delle biotecnologie è stata messa a punto da ricercatori di Medimmune (LINK), azienda del Maryland, che hanno creato un anticorpo ibrido a partire da due anticorpi monoclonali, ossia anticorpi dotati della capacità di legarsi a un “bersaglio” altamente specifico che possono essere creati con tecniche di ingegneria genetica e prodotti in notevoli quantità. In particolare, il nuovo anticorpo è stato ottenuto a partire da due distinti anticorpi monoclonali diretti contro Pseudomonas aeruginosa e ha dimostrato di essere più efficace della somministrazione contemporanea dei due anticorpi monoclonali originari.

La crescente difficoltà a trovare nuove molecole antibiotiche efficaci ha indirizzato l'interesse della ricerca verso gli anticorpi monoclonali, che potenzialmente offrono una maggiore specificità e sicurezza, assenza di interazioni farmacologiche e possibilità di sfruttare modalità di azione complementari rispetto a quelle degli antibiotici, riducendo drasticamente il rischio dello sviluppo di ulteriori resistenze. Tuttavia, il fatto che gli anticorpi monoclonali si legano a ben specifiche, minuscole regioni della membrana batterica fa sì che la loro efficacia si dimostri a volte marginale.

Antonio DiGiandomenico – (articolo pubblicato su “Science Translational Medicine”) e colleghi hanno però ipotizzato che un anticorpo che avesse contemporaneamente come bersaglio due molecole della membrana batterica, e non una, avrebbe potuto portare a effetti migliori. Per questo hanno sviluppato una tecnica che ha permesso di “fondere” in un unico anticorpo due anticorpi monoclonali contro P. aeruginosa – uno dei batteri antibioticoresistenti fra i più problematici – già individuati dallo stesso gruppo di ricerca

Il primo colpisce un polisaccaride della membrana batterica (Psl) che permette a P. aeruginosa di aderire alle cellule dell'ospite e di creare biofilm batterici, mentre il secondo blocca la proteina PcrV  che forma gli “inniettosomi” del batterio, ossia le strutture aghiformi presenti sulla sua superficie che permettono l'iniezione di tossine batteriche nelle cellule dell'ospite. 

Un anticorpo monoclonale blocca la struttura con cui P. aeruginosa inietta tossine nella cellula. (Cortesia MedImmune LLC)

I successivi test hanno mostrato che il nuovo anticorpo bispecifico, chiamato BiS4aPa, non solo aveva un'efficacia maggiore dei due anticorpi separati, ma che, se venivano contemporaneamente somministrati antibiotici ne potenziava l'attività. Alla luce dei risultati ottenuti, i ricercatori hanno quindi messo a punto una formulazione di BiS4aPa adatta alla somministrazione all'essere umano, indicata con la sigla MEDI3902, e iniziato uno studio clinico di fase I per valutare la sicurezza. 

Uno studio del 2001 ha ipotizzato il trasferimento orizzontale di alcuni geni di ceppi microbici, legati alla resistenza ad un farmaco.

Ciò è riportato nel seguente articolo:

Resistenza batterica e scambio di geni

Una nuova teoria sull'acquisizione della resistenza agli antibiotici da parte di Staphylococcus aureus

Una nuova importante ipotesi giunge dallo studio, effettuato dai ricercatori del National Institute of Allergy and Infectious Disease statunitense. 

L'analisi accurata del genoma di 36 ceppi diversi di Staphylococcus aureus ha evidenziato una grande variabilità genetica: più del 20 per cento dei geni sono diversi tra i vari ceppi e contengono informazioni non essenziali per la loro replicazione e patogenesi, ma importanti per la colonizzazione e la resistenza in specifici ambienti e ospiti. In particolare, l'analisi dei ceppi resistenti alla meticillina ha dimostrato che il loro patrimonio genetico è talmente diversificato da escludere una loro evoluzione a partire da un singolo ceppo. 

Secondo quanto sostenuto dagli autori dello studio "la sola ragionevole interpretazione dei dati è che i ceppi resistenti alla meticillina si siano originati per vie indipendenti grazie al trasferimento orizzontale del gene che conferisce resistenza tra diversi precursori inizialmente sensibili all'antibiotico". 

Lo "scambio di geni" tra ceppi diversi avrebbe dunque rivestito un ruolo fondamentale nell'evoluzione di questa specie batterica.

Tratto da:http://www.lescienze.it/news/2001/07/15/news/resistenza_batterica_e_scambio_di_geni-5910

Nel dettaglio:

                                                     Trasferimento genico orizzontale

Il trasferimento di geni orizzontale o trasferimento genico orizzontale (acronimo TGO), anche conosciuto come trasferimento di geni laterale (acronimo TGL) e come HGT (horizontal gene transfer), è un processo nel quale un organismo trasferisce materialegenetico ad una altra cellula non discendente.

Il suo contrario è il trasferimento verticale, vale a dire il fenomeno della riproduzione, col quale un organismo riceve il materiale genetico dei suoi antenati dai suoi genitori. La maggior parte degli studi sopra la genetica si sono incentrati in prevalenza sul trasferimento verticale, ma attualmente c'è la sensazione che il trasferimento orizzontale sia un fenomeno significativo. Il trasferimento artificiale di geni orizzontali è una forma di ingegneria genetica. 

tratto da:(http://it.wikipedia.org/wiki/Trasferimento_genico_orizzontale)