LA NUOVA FRONTIERA CONTRO LE MALATTIE: LA PROTEOMICA

CHE COS’E’ IL PROTEOMA?

Termine derivato dalla fusione delle due parole ‘proteina’ e ‘genoma’, il proteoma sta a indicare l’insieme di tutte le proteine espresse dal genoma di un organismo. Il proteoma è un’entità dinamica, perché costantemente variabile nel corso del tempo. All’interno di un intero organismo, sono presenti molti tipi cellulari diversi, ognuno caratterizzato da un peculiare proteoma, a seconda del tessuto di appartenenza. La conoscenza del proteoma richiede di andare oltre la semplice sequenza nucleotidica del genoma e la costituzione amminoacidica delle proteine, perché le caratteristiche strutturali di questi elementi, nonché le loro numerose interazioni reciproche, ne modificano in modo importante la funzione. Per queste ragioni, la cosiddetta proteomica − lo studio del proteoma − può caratterizzare un organismo e il suo comportamento in modo più preciso rispetto al solo studio del genoma.

http://www.treccani.it/enciclopedia/proteoma_%28Enciclopedia-della-Scienza-e-della-Tecnica%29/

LA PROTEOMICA

La proteomica è una scienza che mira ad indagare e a stabilire l’identità, la quantità, la struttura e le funzioni biochimiche e cellulari di tutte le proteine presenti in un tessuto, in una cellula o in un compartimento sub-cellulare descrivendo come queste proprietà siano variabili nel tempo o in un determinato stato fisiologico. Obiettivi della proteomica sono:

- Comparazione tra tessuti normali e tessuti malati

-Comparazione tra tessuti malati e trattati farmacologicamente

- Identificazioni di nuovi bersagli proteici per farmaci

- Studio delle modificazioni post-traduzionali

- Strategie integrate con la genomica

- Analisi dei tessuti nelle patologie tumorali.

SYSTEM BIOLOGY

La proteomica ed altre metodiche di indagine complementari (genomica, microarray, metabolmica) costituiscono i componenti essenziali di un nuova ed emergente tipologia di studio, la system biology. Essa è una disciplina biologica che studia gli organismi viventi in quanto sistemi che si evolvono nel tempo, ossia nell'interazione dinamica delle parti di cui sono composti. In particolare questo obiettivo viene conseguito tramite l'integrazione di modelli dinamici e dei risultati di differenti esperimenti ad alto rendimento (high-throughput), unendo nella pratica per esempio le conoscenze di genomica, proteomica, trascrittomica e di teoria dei sistemi dinamici. La disciplina utilizza quindi ampiamente gli approcci della teoria dei sistemi, della bioinformatica e della matematica-statistica con l'obiettivo di arrivare a creare un modello sempre più completo del funzionamento dei sistemi biologici.

PER SAPERNE DI PIU’: http://www.treccani.it/enciclopedia/systems-biology_%28XXI_Secolo%29/

CELLULE BERSAGLIO PER SCONFIGGERE I TUMORI

La proteomica viene impiegata per individuare una particolare proteina, chiamata anche marcatore, che permette di differenziare due stati dell’organismo. Questo approccio è molto utilizzato per ricercare proteine marcatore che possono differenziare le cellule sane da cellule tumorali. Una metodicha utilizzata in questo campo è chiamata SILAC (Stable isotope labelling with amino acids in cell culture). Questa tecnica prevede la coltivazone delle cellule sane in un terreno “light” (normale), contrariamente le cellule tumorali vengono coltivate in un terreno “heavy” cioè contenente 2 aminoiacidi con isotopi pesanti non radioattivi (lisina e arginina). Dopo circa 5 duplicazioni cellulari, le cellule tumorali avranno incorporato completamente gli aminoacidi marcati e di conseguenza tutte le proteine tumorali saranno marcate con isotopi pesanti. Dopo questo passaggio vengono raccolte le cellule ed estratte le proteine dai due campioni, le proteine estratte da cellule sane e tumorali vengono miscelate insieme in un rapporto esattamente 1:1. A questo punto avremo una grandissima quantità di proteine che dovranno essere separate attraverso processi cromatografici (HPLC o elettroforesi monodimensionale) per rendere più semplice il campione. Tutte le frazioni ottenute dalla separazione dovranno essere “digerite” con proteasi, cioè enzimi che tagliano altre proteine in frammenti più piccoli. Grazie all’utilizzo di spettrometri di massa ad alta precisione e risoluzione è possibile determinare l’esatto peso molecolare (fino alla terza, quarta cifra decimale) dei differenti peptidi. Ogni proteina sarà caratterizzata da una forma leggera proveniente dalle cellule sane e una forma pesante proveniente dalle cellule tumorali. I segnali ottenuti con spettrometro di massa sono caratterizzati da una certa intensità; nel caso che la proteina non marcata abbia una intensità paragonabile alla forma marcata, significa che la proteina è espressa nella stessa quantità sia nella cellula tumorale che nella cellula sana. Se il segnale della forma pesante è invece molto più intenso (3-10 volte) rispetto al segnale della proteina non marcata, indicherà che la proteina è fortemente sovraespressa nelle cellule tumorali. Dopo aver confermato questo esperimento con altre studi, questa proteina marcatore potrà diventare un possibile bersaglio per farmaci antitumorali specifici.

DIAGNOSI DELLE PATOLOGIE ONCOLOGICHE: TUMORE AL POLMONE

Tra le patologie oncologiche, il cancro al polmone, uno dei tre tumori più diffusi, è l’unico a mostrare la più alta mortalità a causa dei fallimenti nel diagnosticarlo precocemente. Esistono attualmente numerosi biomarker a DNA come la ipermetilazione dei promotori e le mutazioni del K-ras.  I biomarker proteici comprendono: l’antigene carcinoembrionale (CEA), CYFRA21-1 (frammenti di citocheratina 19) , la callicreina plasmatica B1 (KLKB1), l’enolasi neuronespecifica  Tuttavia, a dispetto dei numerosi studi, pochi sono risultati essere utilizzabili in clinica, ad eccezione delle mutazioni del K-ras che consentono di prevedere la risposta del paziente al farmaco biologico cetuximab, nome commerciale Erbitux®, un anticorpo monoclonale diretto contro il recettore del fattore di crescita epidermico. Nell’espettorato si possano riscontrare cellule tumorali o parti di esse. Nelle biopsie di tessuto polmonare, si riscontrano non solo cellule tumorali ma anche altre molecole coinvolte nei meccanismi di difesa dell’organismo come, cellule immunitarie, citochine, etc.. derivate dalle risposte immune o infiammatoria. Anche se è possibile usare liquido pleurico, ascite, urine, il sangue è il liquido biologico maggiormente utilizzato per l’individuazione e l’analisi di biomarker sia per la sua facile accessibilità che per il suo utilizzo routinario nelle analisi chimicocliniche. Nel sangue si riversano biomarkers riscontrabili nelle biopsie tumorali e molti frammenti proteici generati nel microambiente dei tessuti patologici o dalle proteine circolanti secrete dal tessuto malato. Dopo adeguata preparazione ogni proteina può essere analizzata attraverso procedure di identificazione, verifica e validazione. Per l’identificazione proteica si utilizza la spettrometria di massa; LC-ESI-MS/MS e MALDI-TOF/MS sono le piattaforme più comunemente utilizzate. I Biomarkers potenziali, il cui livello di espressione aumenta o diminuisce sono confermati con tecniche di Western Blot o ELISA.

DIAGNOSI DI MALATTIE INFETTIVE: LA TUBERCOLOSI E LA SARS

 La tubercolosi affligge milioni di persone e i Mycobacterium tubercolosis costituiscono un problema sanitario in crescita. Uno screening sierico in grado di determinare le infezioni pre-cliniche permetterebbe trattamenti precoci, riducendo potenzialmente la trasmissione dell’infezione.  Le tecniche proteomiche hanno identificato proteine secrete in vitro da questi ceppi batterici. Due di queste (rRV e rRV) hanno mostrato negli studi clinici la loro potenzialità di antigeni per la diagnostica serica, con una sensibilità del 60-74 % e una specificità del 96-97 % (BanK et al. Proteomics 2004, 4:3299-3307).

La patogenesi di sindromi respiratorie acute (SARS) non è ancora ben compresa e metodi diagnostici specifici sono critici per il management e il controllo della malattia. L’analisi proteomica serica di pazienti affetti da SARS ha identificato dei marker potenziali – forme troncate di α(1)-antitripsina - espresse ad alte concentrazioni nel siero di pazienti SARS positivi rispetto a soggetti sani. Questi marker proteici possono essere usati sia nella diagnostica che come bersagli terapeutici. Inoltre l’indagine delle strutture proteiche dei virus SARS può rivelare potenziali target per la produzione di vaccini.

OPPORTUNITÀ IN TERAPIA: CHEMIOTERAPIA ONCOLOGICA

La resistenza delle cellule tumorali alla chemioterapia può essere piena di sfaccettature e comprenderne le cause può aiutare a migliorare le terapie esistenti e aiutare a proporre nuovi trattamenti.  Per esempio nella leucemia linfoblastica acuta infantile sono state identificate delle proteine specifiche che differenziano le cellule farmaco-resistenti da quelle farmaco-responsive. 10 proteine differiscono in struttura ed espressione quantitativa nelle cellule resistenti agli alcoloidi della pervinca (vinblastina, vincristina, vinorelbina) rispetto alle cellule responsive: proteine del citoscheletro (β-tubulina, α-tubulina e actina), proteine che regolano e legano le proteine citoscheletriche (heat shock protein 90β) e proteine coinvolte nel processamento dell'RNA (proteina-F ribonucleare). Alcune di queste proteine non erano state associate a drug-resistance e potrebbero essere utilizzate come nuovi bersagli farmacologici (Verrils et al. J. Biol. Chem. 2003; 278: 45082- 45093).  Nuovi agenti antimitotici come gli epotiloni (sorafenib) derivanti dal batterio Sorangium celloso sono attualmente utilizzati nei trials clinici; studi recenti hanno dimostrato che mutazioni della α-tubulina, il target cellulare degli epotiloni, conferiscono resistenza ai farmaci delle cellule leucemiche. Le stesse cellule erano cross-resistenti al paclitaxel ma ipersensibili agli alcaloidi della pervinca (Verrils NM et al. Chem. Biol. 2003; 10:597-607. Questi studi dimostrano che gli studi di laboratorio focalizzati su specifiche alterazioni proteiche possono indirizzare su approcci terapeutici alternativi.